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        常規的細胞增殖檢測技術

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        ?細胞是以分裂的方式進行增殖的。單細胞生物,以分裂的方式產生新個體。多細胞生物,以分裂的方式產生新細胞,從而補充體內衰老或死亡的細胞,有絲分裂是真核生物進行細胞分裂的主要方式。細胞增殖是生物體生長發育、繁殖遺傳的基礎,所以對細胞增殖的檢測一直是一大研究熱點。

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        ?常規細胞增殖檢測技術包括以下幾種:

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        ?(1)標志蛋白的WB檢測等。

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        ?PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)是增殖細胞相關的核抗原,在DNA復制以及細胞增殖的啟動中起重要作用。Ki67也是一種細胞增殖核抗原,在有絲分裂中維持DNA結構的穩定性,在細胞周期G0期無表達,G1期開始表達,S期和G2期表達量逐漸升高,M期表達量最高,有絲分裂結束后則降解消失。WB實驗可對PCNA或Ki67的表達水平進行檢測,從而間接得知細胞增殖情況。

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        ?優勢:簡便性,廣泛性,無組織特異性。

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        ?劣勢:間接反映細胞增殖的情況。

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        ?(2)EdU檢測

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        EdU (5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)是一種胸腺嘧啶核苷類似物,在細胞增殖時能夠插入正在復制的DNA分子中?;贓dU與熒光染料的特異性反應檢測DNA復制活性?,F多用EdU檢測替代BrdU檢測。

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        優勢:體外實驗,檢測靈敏度高,可與多種抗體或熒光蛋白同時標記。

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        ?劣勢:具有毒性。

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        ?(3)CFSE檢測法

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        羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種熒光染料,可穿透細胞膜,進入細胞后不可逆的與細胞內的氨基結合偶聯到細胞蛋白質上,細胞分裂時,標記熒光平均分配至2個子代細胞中,熒光強度是親代細胞的一半。利用流式細胞儀的488nm激發光檢測。

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        優勢:直接法,活細胞檢測。

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        ?劣勢:CFSE濃度太低,熒光強度不夠;濃度太高,毒性影響細胞增殖。

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        ?(4)CCK8檢測法。

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        ?CCK8檢測法是MTT檢測法的升級版。CCK8檢測試劑中含有WST-8,WST-8是一種類似于MTT的化合物,可被線粒體內的脫氫酶還原生成水溶性的甲臜。細胞增殖越多越快,顏色越深。酶聯免疫檢測儀測定450nm吸光度。

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        ?優勢:簡便,結果直觀,活細胞檢測。

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        ?劣勢:間接反映活細胞數量。CCK8試劑顏色為淡紅色,與含酚紅的培養基顏色相近,不注意的話容易漏加或多加。

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        云克隆公司現推出了活性蛋白產品,活性蛋白對細胞增殖影響的檢測,我們多采用的是CCK8檢測法結合鏡檢觀察。如表皮生長因子活性蛋白(APA560Hu02),其濃度升高后,可刺激3T3細胞增殖,結果如下:

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