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        免疫組織化學(IHC)常見問題及解答

        免疫組織化學技術又稱免疫細胞化學技術,是指用標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應,對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性和分子生物技術的敏感性等巧妙結合,借助顯微鏡的顯像和放大作用,在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等),是單一的靜止的形態學描述,上升到結構、功能和代謝為一體的動態觀察,為疾病的診斷、鑒別診斷和發病機制的研究提供了強有力的手段。

        然而,要想得到一張高質量的免疫組化染色切片也并非易事。由于切片制作和免疫組化染色過程均存在很多步驟或環節,每一個步驟或環節都需要操作者嚴格控制實驗條件,否則可能會影響到最終結果?,F就試驗中遇到得常見問題進行分析總結,給進一步給出解決方案,希望能為幫助相關實驗人員提供實驗成功率。


        免疫組織化學實驗中的常見問題及其解決方法:

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        出現的問題可能的原因處理方法
        1.染色陰性試劑失效重新試驗,設立陽性對照
        漏加試劑
        試劑加入順序顛倒
        組織中無目的抗原表達或表達量太低查閱文獻或數據庫,確定組織中確有目的蛋白強表達。設立陽性對照片,以驗證實驗結果
        一抗與二抗種屬不匹配

        ??仔細確定一抗與二抗種屬無誤,如果一抗來源于兔,則二抗需選擇抗兔二抗,了解一抗的類型,如果一抗是小鼠IgG1,那么二抗應選擇抗小鼠IgG1


        抗體不足提供抗體量,延長孵育時間,如4度反應過夜
        組織未進行抗原修復有些組織需要經過抗原修復才能檢測抗原表達
        在固定和包埋過程中,抗原變形導致表位變化

        采用多種抗原恢復方法

        包埋時控制溫度在58度或低于58度

        沖洗液與反應試劑不匹配調整溶液PH值,注意過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉
        2.染色弱
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        抗體濃度過低提高抗體濃度,孵育時間不能少于60分鐘
        抗體孵育時間過短抗體孵育時間不能少于60分鐘
        標本中目的蛋白表達量低查閱文獻或數據庫,確定組織中確有目的蛋白強表達。設立陽性對照片,以驗證實驗結果
        操作中,切片遺留太多沖洗液,導致試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥)
        孵育時切片未放平,導致抗體流失孵育時,注意切片應水平放置
        蛋白封閉過度封閉時間不要超過10分鐘
        不適當的標本固定方式選擇合適的固定方法
        不適當的抗原修復方式延長抗原修復時間,或者調整抗原修復體系,建議參照生產廠家的說明,同時結合標本的具體情況來確定
        3.非特異性背景染色,全片著色
        抗體濃度過高降低抗體濃度
        抗體孵育時間過長嚴格執行操作規程,最好使用定時器及時提醒,避免造成時間延長
        孵育溫度過高,孵育溫度超過37度建議控制孵育溫度




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