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        蛋白質印跡(WB)常見問題及解答

        蛋白質印跡(Western Blot)是根據抗原抗體特異性結合的原理檢測復雜樣本中的某種蛋白的方法。將混合抗原樣本在凝膠板上進行單向或雙向電泳,經過 PAGE 分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與或標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術廣泛應用于鑒定蛋白以及對蛋白進行定性和半定量分析。

        蛋白質印跡分為蛋白質分離、蛋白質印跡和蛋白質鑒定三個步驟。每個步驟和環節都可能影響到最終結果, 要想獲得理想的實驗結果,每個步驟都不能馬虎?,F就實驗中遇到的常見問題進行分析總結,給出解決方案,以提高蛋白質印跡實驗的成功率。


        一、蛋白質分離-電泳中的問題


        蛋白質印跡實驗是建立在聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE 基礎上的,所以蛋白質印跡有些問題是由前期電泳引起的。因此,在此簡單介紹電泳中出現的問題。

        出現的問題可能的原因處理方法圖例

        1. “ 微笑”()形帶

        凝膠濃度過高; 凝膠中部凝固不均勻,多出現于較厚的凝膠中; 電泳系統溫度偏高選擇合適濃度的凝膠;待凝膠充分凝固后再做實 驗;水浴降溫電泳
        ??2. “皺眉”()形 帶裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡。可在兩板間加入適量緩沖液,以排除氣泡
        3. 拖尾樣品融解效果不佳,分離膠濃度過大引起的加樣前離心;選擇適當的樣品緩沖液,加適量樣品促溶劑; 重新配制電泳緩沖液;降低凝膠濃度
        ???4. 紋理 樣品不溶性顆粒引起的加樣前離心;加適量樣品促溶劑
        5. 條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜檢查電極是否接觸良好; 拔梳子的時候動作輕柔,保證加樣孔的平坦
        6. 條帶向兩邊擴散加樣量過多樣本在上樣前先進行蛋白定量,根據具體濃度選擇 合適的上樣量


        二、蛋白質轉印-轉膜中的問題


        轉膜是蛋白質印跡實驗中關鍵的一步。轉膜不完全和轉膜過度都會導致轉膜效率低,而導致在檢測鑒定時出現信號弱或無信號的情況。優化轉膜條件可有效提高轉膜效率。


        轉膜中的常見問題及解決方法:


        出現的問題不完全轉膜

        將轉膜后的膠染色確定轉膜效率,同時可用麗春紅染膜;

        優化轉膜時間和電流,分子量大的蛋白可以適度延長轉印時間;

        實驗中加入陽性對照和/或 Marker;

        按照膜的使用說明預先潤濕膜;

        轉膜過程中膠與膜完全接觸



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