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        如何讓WB的結果更完美?

        Western BlotWB)的實驗過程中,總會遇到各種各樣的問題:沒有條帶,雜帶多,轉膜不成功,曝光時間把握不好……不要著急,根據多年的WB經驗,我們總結了以下WB實驗過程中出現各種突發狀況的分析和處理方法:

        1. SDS-PAGE出現異常條帶

        1)微笑現象

         

        處理方法:可能是由于凝膠的中間部分凝固不均導致,待其充分凝固后再做實驗。

        2)拖尾現象

         

        處理方法:可能是由于樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起。建議:加樣前離心;加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長,重新配制;降低凝膠濃度。

        3)條帶粗

         

        處理方法:可能是由于濃縮膠未濃縮好。建議:增加濃縮膠長度;保證濃縮膠的pH正確(6.7);降低電壓。

        4)紋理現象

         

        處理方法:可能是由于樣本中不溶性顆粒引起的。建議:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。

        2. 轉膜條件及膜的選擇

        下圖為不同轉膜方法的轉膜效率:

         

        可以觀察到轉膜效率:濕轉過夜>濕轉3小時>半干轉1小時。

        在轉膜過程中,靶蛋白分子量小轉印時間縮短,分子量大則適當延長轉膜時間。并建議優先選擇聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜,相對硝酸纖維素(NC)膜機械強度高,和蛋白結合牢。

        3. 條帶出現降解或斷裂帶

         

        lane 13:心臟組織震動溶解2h;lane 14:心臟組織短時超聲;lane 15:心臟組織超聲10min


        處理方法:樣本制備過程中盡量保持低溫,避免蛋白變性、降解、斷裂,對于胃腸胰等蛋白酶含量高的樣本建議添加蛋白酶抑制劑,蛋白酶抑制劑建議新鮮配制。

        4. 曝光時間過長或過短出現非特異性帶或條帶消失

         

        處理方法:建議選不同時間點多曝光幾次。

        5. 條帶不整齊

         

        處理方法:可能是由于膠凝固不均勻,建議待膠完全凝固后上樣;可能是由于電泳的時候,有氣泡在膠的下邊緣,建議電泳前,檢查并趕走膠底部的氣泡;可能是由于上樣buffer不是工作液濃度,建議重新配置上樣buffer;可能是由于拔梳子導致樣品孔不齊,建議水平緩慢的拔梳子。

        6. 無條帶

         

        處理方法:可能是轉膜失敗,可以通過立春紅染色檢驗;可能是一抗二抗用錯或濃度不合適,可設置陽性對照或重新調整抗體濃度;ECL發光底物失效,可換用新的發光底物。

         

        WB的實驗流程相對較長,每個步驟都會對最后的實驗結果造成影響。我們在實驗過程中,應做好實驗對照、實驗記錄,步步監測,方便查找原因。

         


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