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        浪費時間且耗費試劑,ELISA實驗為什么要做預實驗呢?

        說到預實驗,相信做科研的你們一定不陌生。預實驗是開展正式實驗前必不可少的環節之一,主要用于摸索合適的實驗條件及確定實驗的可行性。而使用商品化的ELISA試劑盒,實驗條件和實驗流程都已確定,為什么還要浪費時間且耗費試劑去做預實驗呢?

        下面就聊聊ELISA實驗中的預實驗。 為什么要做預實驗??? 01 熟悉實驗操作 不同的商業化的試劑盒產品,對于操作細節都會有所差異。比如試劑盒的溫育溫度,有些是4度,有些是常溫,還有些需要在37度恒溫條件下反應。使用商業化的試劑盒,需要嚴格按照試劑盒的說明書要求完成實驗,不要因為操作步驟與平時的實驗習慣不同,就隨意改變說明書中的操作,導致不理想的實驗結果。在正式實驗之前,熟悉下整體實驗操作流程是有必要的。 02 優化實驗方案 做預實驗時,可以記錄下使用過程中出現的疑問,得到結果后,進行總結分析,并可聯系試劑盒廠家的技術人員給出建議,確保正式實驗有序進行。 03 預測樣本量,確定樣本最適稀釋倍數 商業化的試劑盒在出廠驗證時,會測定不同種類的樣本,確定試劑盒測樣的有效性。通常,對于成分穩定的血清血漿樣本,可根據說明書中推薦的稀釋倍數完成實驗。另外,由于試劑盒廠家獲取樣本的渠道有限,一般只能驗證正常個體的血清血漿樣本,而某些靶標物在疾病、服用藥物等生理狀態下,表達量也會不同,這種情況下,也需要通過預試驗確定樣本最適稀釋倍數后,再進行大量樣本的測定。 不同于血清血漿,有些樣本存在諸多影響靶標物含量的干擾因素,如:組織樣本的干擾因素包括:組織類型、提取方式、刺激處理方式等;細胞樣本的干擾因素包括:細胞狀態、細胞數量、采樣時間、刺激處理方式等;尿液&唾液&乳汁樣本的干擾因素包括:飲水量、采樣時間、采樣方式等。這些干擾因素均會直接影響樣本中靶標物的濃度,建議實驗前先通過預試驗,預測樣本中靶標物的含量,確定樣本最適稀釋倍數,再進行正式實驗。還有一些特殊樣本,如:**灌洗液、**、齦溝液,試劑盒生產廠家不易獲取,也不會用于試劑盒的驗證,且相關的研究報道不多,這類樣本也有必要先做預試驗,摸索合適的樣本稀釋倍數,再開展正式實驗。 顯然,預試驗不僅不會造成試劑和樣本的浪費,用少量的樣本和試劑完成預試驗確保正式實驗大量樣本的測定能夠有序進行,經濟且省時省力。 如何設計ELISA預實驗??? 01 實驗樣本的選擇 預實驗一般通過測定少數有代表性的樣本來確定正式實驗方案。如何選擇有代表性的樣本開展預實驗呢?通常,測定的樣本會分為不同的組別,不同組別的樣本由于前期處理or刺激后,靶標物的表達量會產生變化,建議從各組樣本中隨機選擇1-2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數量多,分配到預實驗的試劑量有限,那么至少選擇兩例樣品,建議選用1例為理論上靶標物含量最低組的樣品,另1例為理論上靶標物含量最高組的樣品。 02 最適稀釋倍數的確定 將樣本梯度稀釋,可根據樣本中靶標物的濃度,選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋,同時測定標準品。標準品的制備需按照試劑盒說明書的要求,試劑量充足可以選擇一條完整的標曲,試劑量有限也可以選擇部分濃度點(如空白孔、最低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔)。將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的O.D.值與梯度濃度標準品O.D.值進行對比,最佳稀釋倍數為此倍數稀釋后全部/絕大多數樣本O.D.值能夠位于標準曲線中間濃度孔對應的O.D.值,即標準曲線的最佳擬合區域。需要注意的是在做預實驗時,一定要設置標曲,不設置標曲,就如同在丈量時沒有尺一樣,無法通過比較確定最適稀釋倍數。 03 顯色時間的確定 顯色是ELISA實驗中最后一步溫育反應,固定在酶標板上的酶催化無色底物生成有色產物。由于ELISA實驗會受到環境差異及實驗操作差異的影響,商業化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間,而是建議實驗操作人員根據顯色情況判斷合適的顯色反應時間。加入底物后可定時觀察反應孔的顏色變化(如每隔5分鐘觀察一次),當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止。通過預實驗熟悉操作的同時,也能確定合適的顯色時間。


        想要被實驗溫柔對待,可不能忽視“不可或缺”的預實驗呀。想必大家對于預實驗也有很多心得體會,請在評論區留言吧,讓我們聽聽你們的聲音。


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