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        云克隆教你出完美Western Blot條帶

         

        在Western Blot(WB)的實驗過程中,總會遇到各種各樣的問題:沒有條帶,雜帶多,轉膜不成功,曝光時間把握不好……WB實驗周期長,操作步驟繁瑣。怎么在繁瑣的操作中快速找到問題所在是很多科研人員頭疼的問題。不要急,云克隆用多年積攢的WB實驗經驗,為你分析解決WB實驗過程中出現的各種狀況。

         

        一、SDS-PAGE出現異常條帶

        1. 微笑現象

         

        可能原因:凝膠的中間部分凝固不均導致。

        解決辦法:待其充分凝固后再做實驗。

        2. 拖尾現象

         

        可能原因:樣品融解效果不佳;電泳緩沖液時間過長;分離膠濃度過大引起。

        解決辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長,重新配制;降低凝膠濃度。

        3. 條帶粗

         

        可能原因:蛋白在濃縮膠中未濃縮好。

        解決辦法:增加濃縮膠長度;保證濃縮膠的pH正確;降低電壓。

        4. 紋理現象

         

        可能原因:樣本中有不溶性顆粒。

        解決辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。

         

        二、如何選擇轉膜條件及膜

        下圖為不同轉膜方法的轉膜效率對比,展示轉膜后膠上剩余條帶:

         

        結論:

        轉膜效率:濕轉過夜>濕轉3小時>半干轉1小時

         

        NC膜和PVDF膜對比:


        NC膜

        PVDF膜

        物理強度

        溶劑耐受力

        SDS存在下蛋白質結合力

         

        因此,針對轉膜我們有以下建議:

        1. 在轉膜過程中,靶蛋白分子量小轉膜時間適當縮短,分子量大則適當延長轉膜時間;

        2. 優先選擇聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,其相對硝酸纖維素(NC)膜機械強度高,和蛋白結合牢。

         

        三、WB案例分析

        1. 條帶出現降解或斷裂帶

         

        lane 13:心臟組織震動溶解2h;

        lane 14:心臟組織短時超聲1~3min;

        lane 15:心臟組織超聲10min.


        處理方法:樣本制備過程中盡量保持低溫,避免蛋白變性、降解、斷裂,對于胃腸胰等蛋白酶含量高的樣本建議添加蛋白酶抑制劑,蛋白酶抑制劑建議新鮮配制。

        2. 曝光時間過長或過短出現非特異性帶或條帶消失

         

        處理方法:建議選不同時間點多曝光幾次。

        3. 條帶不整齊

         

        原因分析和處理方法:

        1)可能是由于膠凝固不均勻,建議待膠完全凝固后上樣;

        2)可能是由于電泳的時,有氣泡在膠的下邊緣,建議電泳前,檢查并趕走膠底部的氣泡;

        3)可能是由于上樣buffer不是工作液濃度,建議重新配置上樣buffer;

        4)可能是由于拔梳子導致樣品孔不齊,建議水平緩慢的拔梳子。

        4. 無條帶

         

        原因分析和處理方法:

        1)可能是轉膜失敗,可以通過麗春紅染色檢驗;

        2)可能是一抗二抗用錯或濃度不合適,可設置陽性對照或重新調整抗體濃度;

        3)ECL發光底物失效,可換用新的發光底物。

        5. 雜帶多

         

        原因分析和處理方法:

        1)非特異條帶,可能是一抗特異性不好,也有可能是二抗,可以更換抗體試試;

        2)蛋白有多個isoform,或者是前體、剪切、修飾;

        3)樣本制備過程中蛋白出現降解或者斷裂帶,重新制備樣本。

         

        WB的實驗流程相對較長,每個步驟都會對最后的實驗結果造成影響,在實驗過程中應步步監測,做好質控,以便隨時發現問題、找到問題。云克隆希望能為廣大的科研人員在科研道路上少走彎路盡自己的一份微薄之力。

         


         


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