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        知悉ELISA實驗影響因素,新手也能獲得完美的實驗結果


        提到ELISA實驗,相信大家都非常熟悉。盡管ELISA實驗操作相對簡單,但在實驗中總會遇到或多或少的問題,導致實驗進展受阻,給實驗者帶來不少困擾。今天,小云就給大家介紹一下ELISA實驗影響因素,希望能夠為您的ELISA實驗順利進行保駕護航。


        樣本因素

        樣本因素可分為內源性影響因素和外源性影響因素。

        一、內源性影響因素

        大約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質,可以不同程度影響檢測結果,導致出現假陽性或假陰性的結果。常見的干擾物質有:類風濕因子、補體、交叉反應物質和異嗜性抗體等其他物質等。以類風濕因子和補體為例。

        1) 類風濕因子:在類風濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產生非特異結合的特點,因為在ELISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合,從而出現假陽性結果。

        2) 補體:在固相酶免疫測定中,來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系統的功能。一方面,固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗體分子發生變構,使Fc段的補體C1q結合點暴露出來,使C1q成為一個中介物將二者交聯起來出現假陽性結果。另一方面,固相抗體也會因為活化補體的結合,封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰性。


        二、外源性影響因素

        1) 樣本溶血:溶血樣本及混有紅細胞的血清采用ELISA法檢測易產生假陽性,這是由于溶血樣本中含有大量過氧化酶物質(紅細胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素),在洗滌過程中往往難以完全洗脫,它可使H2O2釋放出原生態氧(O),從而催化底物四甲基聯苯胺生成可溶性的有色物質,即顯藍色,產生假陽性。所以嚴重溶血樣本不推薦使用。

        2) 樣本受細菌污染:因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶,因此,被細菌污染的樣本同溶血樣本一樣,亦可產生非特異性顯色而出現假陽性而干擾測定結果。

        3) 樣本保存不當:樣本保存時間過長可能因蛋白降解或變性而導致實驗結果偏差,為克服上述干擾,ELISA測定的樣本宜為新鮮采集。如不能立即測定,1周內測定的樣本可存放于4℃,1周后測定的樣本應分裝低溫凍存。樣本推薦按使用量分裝以避免反復凍融,反復凍融也會導致蛋白降解或變性。凍存后融解的樣本,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混合后再測定,但混勻時應輕柔,不可強烈振蕩。

        4) 抗凝劑的干擾:肝素抗凝血漿會增加OD值,EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性。

        5) 樣本脂肪含量過高:樣本中的脂肪含量過高,會干擾抗原抗體反應,造成假陰性。通過冷凍高速離心處理后,高脂樣本會分層,取樣時應避免吸取上層脂肪層,取中間澄清段進行檢測。

        6) 樣本的制備:樣本的收集時間、處理方法和保存方式都會影響ELISA實驗的結果。小云整理了樣本處理方法,供研究者參考。

        酶聯免疫吸附測定實驗(ELISA)常見樣本處理方法

        http://www.xavierpita.com/topic/201804271043087152.html

        酶聯免疫吸附測定實驗(ELISA)特殊樣本處理方法

        http://www.xavierpita.com/topic/201805141347467275.html


        試劑因素

        一、抗體的純度、親和力、滴度和特異性

        抗體是ELISA測定最為核心的原料之一,抗體的品質決定著ELISA測定的準確性。選擇純度高、親和力強及特異性強的抗體,可以有效提高試劑盒的靈敏度和特異性,且能保障檢測的準確性。

         

        二、標準品定值的準確性

        標準品定值是定量ELISA測定最為關鍵的因素之一,其中標準品定值的準確性決定了ELISA定量測定的準確性。需選用純度高,穩定性好的抗原物,并精準定量,以確保ELISA定量測定的有效性。

         

        三、標記物的活性

        ELISA反應中常用到酶標記物、生物素標記物或熒光標記物等。受檢樣本中靶物質的量與固相載體上標記物的量呈正比例或反比例關系,根據信號值(酶催化有色產物呈色深淺或熒光信號)進行定性或定量分析。標記物的活性,可放大反應效果,從而提高ELISA測定的靈敏度。

         操作因素

            以云克隆ELISA試劑盒產品為例,小云整理了操作tips和Trouble shooting。

        一、操作tips

        1) 試劑準備

        ① 標準品倍比稀釋及樣本的稀釋不推薦在板孔中進行,避免產生氣泡;


        ② 在試劑配置和樣本稀釋時,盡量避免吸取10uL以下液體,否則會造成誤差較大;

        ③ 用移液器吹打混勻避免產生氣泡,避免用力過大將試劑吹出管外;

        ④ 標準品、檢測液A工作液體以及檢測液B工作液體需臨用前10min配置;

        ⑤ 配置檢測液A/B工作液時,用微量移液器吸取對應量檢測液A/B稀釋液,不可直接將試劑瓶中的檢測液A/B稀釋液傾倒出,否則會造成所取液體量不準確;

        2) 加樣

        ① 加樣時吸頭需垂直懸空加入,吸頭不要傾斜或接觸孔壁或孔底;


        ② 加不同的樣本需要更換吸頭,避免交叉污染;

        ③ 樣本數量較多時,需要加快加樣速度,整板加樣時間最好控制在10min內,避免不同孔間反應時間相差太大,造成結果不準確;

        ④ 加入檢測液A/B工作液以及洗液可以采用多道移液器加樣,使用多道移液器加樣注意吸頭液面平齊,并垂直懸空加樣,避免加到孔外或鄰孔;


        ⑤ 加入不同試劑后需要更換新覆膜,避免交叉污染;

        1) 溫育

        ① 溫育時,需蓋上覆膜;

        ② 溫育時,恒溫箱需提前預熱使溫度恒定至37℃;

        ③ 溫育時,酶標板需平放,不要疊放或傾斜;

        4) 洗滌

        ① 溫育結束后,取出酶標板,撕去覆膜,注意不要用力過猛,導致孔內液體濺出,污染鄰孔;

        ② 甩板時應垂直,以免不同孔間液體交叉污染,甩板時盡量將孔內液體甩干凈;

        ③ 使用洗板機,洗板前后,洗板機應用去離子水清洗幾遍,洗板過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況;

        ④ 無洗板機,可用多道移液器進行洗板,洗板后需盡快進入下一步操作,避免酶標板空板時間過長;

        5) 顯色

        顯色需在37℃避光顯色,顯色過程中每隔5min觀察顏色變化,以便及時終止,顯色時間推薦控制在10-20min內,如顏色較深,可提前終止。如顯色20min顏色梯度仍然不明顯,可延長顯色時間至30min,不要超過30min。

        6) 讀數

        提前打開酶標儀預熱,加入終止液需立即450nm讀數,讀數前確??變葻o氣泡以及板底無水滴;


        二、操作Trouble shooting



        綜上所述,在ELISA測定中存在著各種影響檢測結果的干擾因素,要從多方面進行分析,除試劑因素和操作因素之外,更多的應從樣本因素方面進行分析,并采取相應措施排除干擾作用,以獲得正確可靠的檢測結果。




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