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        Luminex試劑盒標準曲線擬合和樣本計算方法

        云克隆基于國際最新Luminex xMAP技術開發推出了Luminex檢測試劑盒。Luminex技術使用流式細胞術分析不同熒光標記的微球,同時對多種不同的生物學指標進行檢測。

        Luminex試劑盒的數據如何完成標曲擬合及樣本計算呢?能否用EXCEL軟件完成呢?接下來我們以 Cloud-Clone  Corp.的 LMA079Hu  人白介素6(IL6)單因子檢測試劑盒(流式熒光發光法)及LMA461Ge  雌二醇(E2)單因子檢測試劑盒(流式熒光發光法)實驗結果為例,展開詳細介紹。

         LMA079Hu  利用雙抗夾心法定量測定樣本中IL6含量。如圖1所示,最高濃度的標準品(500pg/mL)經4倍倍比稀釋至0.49pg/mL,空白孔為標準品稀釋液(0濃度孔)。

        圖1. 標準曲線數據

         首先將標準品各孔的MFI值減去空白MFI值(本底),得到校正MFI值,以標準品各孔的校正MFI值取Log10后的值為X軸(標黃色),標準品相應濃度取Log10后的值(標紅色)為Y軸,作XY散點圖,得到一條6點曲線,其中X軸為校正MFI的對數值(Log of MFI),Y軸為濃度的對數值(Log of Conc.),如圖2所示。

        圖2. 標準曲線示例圖

        接下來我們看看如何做出圖2中的標準曲線,選中Log of MFI及Log of Conc.各數據(標黃色及紅色區域),左鍵點擊插入,再左鍵點擊XY散點圖(見圖3A)。圖表上便會彈出散點圖(見圖3B),鼠標左鍵點擊曲線中的任何一點,圖中6點都會被選中,點擊鼠標右鍵,在菜單欄中選擇“添加趨勢線”。在頁面右邊出現的菜單欄里左鍵點擊“趨勢線”,選擇“多項式(P)”并將“順序”設定為2。最后,勾選“顯示公式(E)”和“顯示R平方值(R)”(如圖3C),便會出現標準曲線的對應公式及R2 值(如圖2所示)。

        圖3A. 標曲擬合過程示意圖A

        圖3B. 標曲擬合過程示意圖B

        圖3C. 標曲擬合過程示意圖C

         

        圖3.  標曲擬合過程示意圖

        得到公式后,將樣本MFI值扣除空白MFI值,得到樣本校正MFI值,將校正MFI值取對數后作為X帶入公式,算得Y值后,做以10為底的指數運算,若樣本原液檢測,計算的Y值為樣本中靶因子的濃度,若樣本稀釋后檢測,計算的Y值乘以稀釋倍數,為樣本中靶因子的濃度。    

        對于一些化學小分子及多肽類物質,常采用競爭法測定,競爭法標曲擬合與雙抗夾心法有所不同,詳細標曲擬合和樣本計算方法如下:

        LMA461Ge利用競爭法定量測定樣本中E2含量。如圖4所示,最高濃度的標準品(1000pg/mL)經4倍倍比稀釋至0.98pg/mL,空白孔為標準品稀釋液(0濃度孔)。

        圖4. 標準曲線數據

        將標準品各孔的MFI值取Log10后的值為X軸(標黃色),標準品相應濃度取Log10后的值(標紅色)為Y軸作XY散點圖,得到一條6點曲線,其中X軸為MFI的對數值(Log of MFI),Y軸為濃度的對數值(Log of Conc.),如圖5所示。

        圖5. 標準曲線示例圖 

        接著,選中Log of MFI及Log of Conc.各數據(標黃色及紅色區域),左鍵點擊插入,再左鍵點擊XY散點圖(見圖6A)。圖表上便會彈出散點圖(見圖6B),鼠標左鍵點擊曲線中的任何一點,圖中6點都會被選中,點擊鼠標右鍵,在菜單欄中選擇“添加趨勢線”。在頁面右邊出現的菜單欄里左鍵點擊“趨勢線”,選擇“多項式(P)”并將“順序”設定為2。最后,勾選“顯示公式(E)”和“顯示R平方值(R)”(如圖6C),便會出現標準曲線的對應公式及R2 值(如圖5所示)。

        圖6A. 標曲擬合過程示意圖A

        圖6B. 標曲擬合過程示意圖B

        圖6C. 標曲擬合過程示意圖C

         

        圖6. 標曲擬合過程示意圖

         

        得到公式后,將樣本MFI值取對數后,作為X帶入公式,算得Y值后,做以10為底的指數運算,若樣本原液檢測,計算的Y值為樣本中靶因子的濃度,若樣本稀釋后檢測,計算的Y值乘以稀釋倍數,為樣本中靶因子的濃度。

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