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熒光素酶（luciferase）在一定條件下可以催化熒光素（luciferin），產生自發光現象（如圖1）。熒光素或熒光素酶不是特定的分子，而是對于所有能夠產生熒光的底物和其對應的酶的統稱。目前比較常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶，海螢熒光素酶等。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶組成的雙報告系統在基因的表達調控、信號通路的轉導作用、高通量藥物篩選、siRNA和miRNA篩選等多個研究領域發揮重要作用。

                           圖1. 熒光素酶與熒光素的發光反應

螢火蟲熒光素酶是目前研究中使用最為廣泛的熒光素酶。它由550個氨基酸組成，翻譯后的蛋白質不需要修飾即可獲得酶活性。高濃度酶的累積幾乎沒有細胞毒性，可用于原核和真核細胞。反應產生熒光的組織穿透能力明顯強于綠色熒光蛋白（GFP）。該反應是酶與底物相互反應發光，具有高特異性；熒光產生的過程不需要激發光的存在，幾乎沒有背景信號，信噪比高。

熒光素酶基因通過基因工程的手段整合到預期觀察的細胞染色體DNA上，可表達具有生物活性的熒光素酶，經過一系列篩選和鑒定就能得到穩定表達熒光素酶的細胞株。當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光素酶也會得到持續穩定的表達。當外源給予其底物熒光素，在ATP和O₂存在的條件下，可在活細胞內產生發光現象，并且發光光強度與標記細胞的數目線性相關。下面以HepG2細胞為例，介紹HepG2-luc穩定細胞系構建的流程。

1 熒光蛋白載體的構建

螢火蟲熒光素酶基因通過分子克隆的方式構建到質粒上。

2. 慢病毒轉染實驗

? 取對數生長期HepG2細胞，胰酶消化調整細胞密度為1×10⁵/ml，種于6孔板內，每孔2ml，將6孔板置于培養箱中繼續培養，待細胞匯合度達到30 %~40 %時，即可進行慢病毒轉染。

? 按照MOI=10計算病毒使用量，然后加入相應量的病毒進行轉染，每孔添加2ug/ml Polybrene作為助轉劑，將6孔板置于培養箱中繼續培養。

? 感染8-12小時后，更換為新鮮培養基，繼續培養72小時。

3. Puromycin抗性篩選

? 取上述轉染好的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，先用新鮮培養基傳代1次，穩定細胞狀態后，可添加含有嘌呤霉素的培養基進行培養。

? 待細胞匯合度達到70%-80%時，吸棄原培養基，加入含1ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養基，繼續培養。

? 用1ug/ml的嘌呤霉素維持培養3天后，更換為2ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養基，繼續培養；3天后再更換為5ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養基繼續培養；3天后再更換為10ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養基，繼續培養；直至沒有病毒感染的對照組細胞全部被Puromycin殺死。

4. 細胞體外生物發光檢測

? 用蒸餾水溶解D-熒光素鈉鹽，配制成30mg/ml的儲存液（200×）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。

?  用預熱好的組織培養基1:200稀釋儲存液，配制工作液（終濃度150μg/ml）

? 去除培養細胞的培養基。

? 待圖像分析前，向細胞內添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析

? 細胞成像結果展示如下：

圖2 HepG2-luc穩定細胞系發光檢測

2.  細胞體內活體成像檢測：

? 裸鼠成瘤：取生長良好的細胞消化后制成細胞懸液，計數后取100μl（含5*106個細胞）的細胞懸液經皮下接種于小鼠，每天正常飲食。

? 動物成瘤后即可進行活體成像

? 1）用無菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液（15mg/ml），0.2μm濾膜過濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

? 2） 注射量取決于注射方式，具體如下：

3） 成瘤的動物 采用腹腔注射即可，注射入體內10-20 min（待光信號達到最強穩定平臺期），再進行成像分析（如圖3）。

                               圖3 成瘤小鼠活體成像檢測

云克隆還為客戶提供過多種luc穩轉細胞系

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