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        Morris水迷宮——為阿爾茨海默癥的研究保駕護航


        今年7月22日,《Science》發表了一篇歷時六個月的調查報告,指稱美國明尼蘇達大學神經學家Sylvain Lesné發表的20余篇論文存在學術不端行為。其中最引人注目的一篇是2006年在《Nature》上發表的,被引用量高達2300多次的阿爾茲海默癥的開創性論文,Sylvain Lesné與團隊成員發現了一種之前未知的β淀粉樣蛋白亞型(Aβ*56)。該文章的通訊作者Ashe教授將Aβ*56稱為在阿爾茨海默研究中,首個從大腦組織中發現,且能導致記憶衰退的物質。該論文的造假可能導致了對阿爾茨海默癥淀粉樣蛋白假說長達16年的誤導性研究,從那時起,許多工作都集中在淀粉樣蛋白上,進展非常緩慢。

         

                                                                                                圖1.2006年發表在《Nature》的阿爾茲海默癥開創性論文被引用量

        據統計,自2006年到2021年,美國NIH《美國國立衛生研究院》對于“淀粉樣蛋白、寡聚體、阿爾茨海默癥”研究經費從幾乎為零,猛增到了近3億美元。僅在2022年,NIH在涉及淀粉樣蛋白的項目上花費了約16億美元(約合108.14億人民幣),約占阿爾茨海默癥總資金的一半。

        阿爾茨海默癥(Alzheimer Disease,AD)是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病,臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特征,病因迄今未明。據世衛組織統計,目前全球有超過5500萬人患有癡呆癥,給社會和家庭帶來巨大的負擔,對阿爾茨海默癥的研究迫在眉睫。

        云克隆可為阿爾茨海默癥的疾病模型提供可靠的操作保證:

        模型來源:通過腦立體定位技術向雙側海馬CA1區注射干擾物質(供試品)

        建模方案:SD大鼠采用1%戊巴比妥鈉40μg/g腹腔內注射麻醉,麻醉后繼而固定于腦立體定位儀上。按照大鼠腦立體定位圖譜,以前囟為零起點,前囟后3.5 mm處為穿刺點,中線右側旁開2mm,而后牙科鉆鉆開顱骨,采用微量注射器自腦表面垂直進針3mm,即:(AP= -3.5 mm, ML=2.0 mm, DV=3.0 mm),雙側海馬CA1區緩慢勻速注射,留針5 min,退針后縫合傷口。

         

                                                                                                                                      圖2.腦立體定位注射操作

        Morris水迷宮作為AD模型的經典行為學實驗,也被稱為AD模型行為學檢測的“金標準”。

        云克隆引進的Morris水迷宮實驗系統,由圓形水池、圖像自動采集和處理系統組成。圖像自動采集和處理系統主要由攝像機、計算機、圖像監視器組成,動物入水后啟動監測裝置,記錄動物運動軌跡,實驗完畢自動分析報告相關參數。

         

                                                                                                                                        圖3. Morris水迷宮圓形水池

        1. Morris水迷宮圓形水池 

        Morris水迷宮圓形水池為一圓柱形水桶,直徑為3000px(小鼠)、高為50-1500px,水池水深為30-1000px,一個圓形平臺直徑約為225px(小鼠),藏匿于25px的水面之下。水池的內部不得有任何標記,在圓桶的上緣等距離地設東、南、西和北4個標記點,作為動物進水池的入水點,以這4個入水點在水面和水桶底部的投影點作為參照位點,將水面和水桶部分均等的分為4個象限,按實驗要求,可任意地將平臺設置于某一象限的中間。適當的恒溫設備使水溫保持在23~25℃。

        2. 水迷宮圖像自動采集和處理系統 

        本系統能自動地采集動物的入水位置、游泳的速度、搜索目標的所需時間和運行軌跡等參數,并可對所采集的各種數據進行統計和分析。

         

         

                                                                                                                                              圖4. Morris水迷宮視頻界面

        實驗步驟

        3. Morris水迷宮實驗步驟

        連續給予受試物后,實驗前一天,小鼠自由游泳2min以熟悉環境,其間引導動物站上平臺10s。次日開始訓練,訓練期間繼續給樣。

        定位航行試驗:用于測量實驗動物對水迷宮學習和記憶獲得的能力。動物每次從1個象限的相同入水點入水,將動物面向池壁放入水中,儀器自動記錄動物尋找并爬上平臺的路線圖、動物從入水到找到水下隱蔽平臺并站立其上所需時間(逃避潛伏期)及游泳總路程。每完成4個象限的訓練當做1個循環,如果動物在90s內未找到平臺,則需將其引至平臺,這時潛伏期以90s計,讓動物在平臺停留10s后,再放回籠中。如此重復完成4個象限的試驗,總共訓練5天,也就是四個循環,象限選擇和各實驗組動物訓練順序應隨機確定或交叉進行。

        空間探索試驗:定位航行試驗結束5天后,將水下平臺撤除,按照定位航行試驗的方法重復1個循環(共4個象限)的試驗,動物每次從1個象限的入水點入水,記錄90s內小鼠在水池4個象限中的游泳距離、路徑、時間,據此推算平臺所在象限數據占總距離、總時間的百分比及穿越平臺的次數,用來反映大鼠對平臺所在位置的空間記憶能力,以判斷動物記憶儲存及提取再現能力。

        4. 數據處理

        將每天動物1個循環(共4個象限)的實驗數據合并統計,對每1個循環各組的結果進行比較分析。

        逃避潛伏期、上臺前游泳路程、平臺象限活動時間占總時間百分比、平臺象限活動路程占總距離百分比、站臺穿越次數屬計量資料,可用unpaired T test進行差異性分析。結論:NS,組間差異無顯著性;*(P<0.05),組間5%的顯著性差異;**(P<0.01),組間1%的顯著性水平顯著;***(P<0.001),組間1‰的顯著性差異。

         

        針對學習與記憶行為學檢測方面,云克隆還可為廣大用戶提供: 

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