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        親環蛋白A精確調控IL-1β介導的炎癥反應

              親環蛋白A(cyclophilin A,CypA)是人類細胞中首個發現具有肽基脯氨酸順反異構酶活性的折疊酶,具有強大的促炎作用,但是有研究者發現它還能抑制炎癥反應。2022年5月,《Cell》雜志上發表了一篇題為“Delicate regulation of IL-1β-mediated inflflammation by cyclophilin A”的文章,在這項研究中,研究者發現CypA通過增加白介素1β(IL-1β)的產生促進炎癥激活,在炎癥消退期促進冗余的pro IL-1β降解和emt介導的肺修復,表明炎癥反應的調控復雜而微妙。

               研究者用野生型(WT)和CypA敲除型(Ppia-/-)小鼠建立了脂多糖(LPS)誘導的肺部炎癥模型。采用蘇木精和伊紅染色以及病理評分來評估肺部炎癥的嚴重程度。發現CypA最初促進(治療后6小時至3天),然后抑制(5至7天)脂多糖誘導的病理性肺損傷。qPCR、ELISA和免疫組化分析的結果也證明這一趨勢?;貧w分析結果顯示IL-1β在肺泡灌洗液(BALF)(R2=0.8411)和血清(R2=0.9533)中的表達量與病理評分呈線性關系。(見圖1)


        圖1 CypA通過IL-1β的表達調節脂多糖誘導的肺部炎癥。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               研究者通過ELISA檢測ATP刺激炎癥小體,在WT的上清液比Ppia-/-的上清液中觀察到更多成熟的IL-1β。在免疫印跡實驗中,觀察到CypA促進了骨髓源巨噬細胞(BMDM)細胞中內源性pro-IL-1β的降解。MG132抑制了pro-IL-1β的降解,說明pro-IL-1β是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。接著,研究者采用質譜法鑒定出pro-IL-1β的三個潛在泛素化位點(K73、K132和K143),K73R、K132R和K143R突變會導致K48-linked pro-IL-1β泛素化水平降低,而K132R和K143R突變會導致K63-linked pro-IL-1β泛素化水平降低。將NLRP3、ASC和caspase-1共轉染到293T細胞中,用ATP刺激60min,研究者發現K143R突變時,IL-1β表達量顯著降低,說明K143R阻止了pro IL-1b分裂成活性的IL-1b,表明K143是pro-IL-1β加工的關鍵位點。(見圖2)

        圖2 CypA通過調節K48-linked和K63-linked泛素化來促進前IL-1β的加工和降解。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               通過免疫共沉淀法檢測E3連接酶與pro-IL-1β或CypA的相互作用,結果顯示,E3連接酶AIP4、RNF5、RNF125和Smurf1與pro-IL-1β相互作用,Smurf1和AIP4與CypA相互作用。然后,研究者通過實驗發現只有Smurf會促進pro-IL-1β的裂解,并促進CypA調節的pro-IL-1β降解。泛素化分析顯示,CypA促進了Smurf1介導的pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。此外,CypA能夠增加293T細胞和BMDMs中Smurf1和pro-IL-1β之間的相互作用,這表明CypA通過增強Smurf1與pro-IL-1β的結合促進了pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。(見圖3)

        圖3 Smurf1參與了Cypa調控的K48-linked和K63-linked pro IL-1β泛素化。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               研究者構建了IL-1β引發的小鼠肺炎癥模型。WT和Ppia-/-小鼠分別用IL-1β處理不同時間。蘇木精和伊紅染色結果、病理評分、肺指數和干濕塊顯示,WT小鼠在處理后1天出現嚴重的肺損傷,處理后7d觀察肺損傷減輕情況,WT小鼠上述各項指標在各時間點均顯著高于Ppia-/-小鼠。隨后,研究者通過ELISA檢測了CypA對細胞因子產生的影響,發現CypA增加了IL-1β處理小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的產生。(見圖4)


        圖4 CypA加重了IL-1β觸發的細胞因子的產生和肺損傷。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               研究者接著研究了CypA在IL-1β觸發的II型EMT中的作用。肺切片染色結果顯示,在IL-1β處理后7天,WT小鼠的肺纖維化程度和評分明顯高于Ppia-/-小鼠。檢測了CypA對IL-1β刺激的人II型肺泡上皮細胞系(A549)細胞遷移和侵襲能力的影響,發現CypA促進了細胞遷移和侵襲。接下來研究CypA是否對EMT的關鍵分子特征有影響。WT和Ppia-/-小鼠肺組織免疫熒光組化檢測顯示,CypA顯著增加β-catenin和α-SMA表達,但降低E-cadherin表達,WB在A549細胞中證實。提示CypA可促進II型肺EMT,促進肺修復。(見圖5)

        圖5 CypA促進IL-1β觸發的EMT進行肺修復。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

                對IL-1β處理的A549/WT和A549/CypA細胞進行了轉錄組和蛋白質組綜合分析。與A549/CypA細胞相比,A549/WT細胞中E-cadherin下調,Zeb1、N-cadherin和β-catenin上調。差異基因和蛋白質的功能分析顯示,ILK和AKT可能通過ILK/AKT信號通路與Cypa調控的EMT相關。用IL-1β對A549和A549/CypA細胞進行不同時間的刺激,以檢測CypA對ILK/AKT信號通路的影響。WB結果顯示,CypA對磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、ILK和AKT的磷酸化水平均有顯著的提高,提示CypA參與了ILK/AKT信號通路的上調。此外,觀察到CypA能夠與ILK相互作用,并進一步增強293T細胞和A549細胞中ILK與AKT之間的相互作用。這些數據表明,CypA通過靶向ILK促進IL-1β誘導的EMT。(見圖6)


        圖6 CypA通過ILK/AKT途徑促進IL-1β誘導的EMT。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               泛素化分析顯示,CypA促進了K63-linked ILK泛素化,而不是K48-linked ILK泛素化,去泛素化酶Cyld參與了CypA對K63-linked ILK泛素化的調控。此外,研究者發現CypA可以抑制A549細胞中Cyld和ILK的相互作用。共免疫沉淀實驗表明,CypA過表達時Cyld-ILK相互作用減弱,表明CypA和Cyld相互競爭ILK相互作用。質譜分析發現了5個ILK泛素化位點(K141、K154、K165、K209和K435)。在這些位點中,只有K141或K154突變導致了ILK的K63-linked泛素化降低和ILK-AKT相互作用中斷。CypA抑制Cyld介導的K141和K154位點 K63-linked ILK 的去泛素化,然后增加ILK-AKT的相互作用,從而上調ILK/AKT通路,促進IL-1β觸發的EMT。(見圖7)


        圖7 CypA抑制Cyld介導的,K63連接的ILK去泛素化。

        (圖片來源于《Cell》雜志)

               總的來說,這些發現表明,CypA不僅促進炎癥激活,還能促進炎癥消退。因此,在炎癥激活階段阻斷CypA是一種潛在的抗炎策略。同時,在考慮使用CypA阻斷治療炎癥時,也不能采取“一刀切”的阻斷CypA。

         

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