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前面小云有介紹衰老與睡眠障礙之間的關系，由此可以看出睡眠對于人體健康起著至關重要的作用。據調查，我國有超3億人存在睡眠障礙，失眠發生率高達38.2%。在小鼠和人類中，睡眠量受遺傳因素的制約，并表現出與年齡有關的變化，但對于調節哺乳動物睡眠時間的核心分子途徑和效應機制仍不清楚。

  北京生命科學研究所劉清華團隊通過對小鼠的研究，發現了調控小鼠睡眠時間的關鍵信號通路，闡明了睡眠時間受轉錄調控的分子機制，幫助人們理解人類的睡眠異?，F象，并為修復或調整睡眠提供指導。相關論文于2022年12月7日發表在《Nature》雜志上。

研究人員通過用重組AAV-PHP.eB病毒對Lkb1^flox/flox成年小鼠進行眼眶后注射，建立腦嵌合體（ABC）模型（含有人突觸素（hSyn）啟動子的Cre重組酶表達系統），并對成年鼠腦嵌合體的Lkb1基因（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因）進行敲除（ABC-Lkb1^KO）。HA-Cre（含血凝素標簽蛋白的Cre）和LKB1的免疫染色證實了在ABC-Lkb1^KO小鼠的不同腦區，有60-99%的表達Cre的神經元出現了LKB1表達的缺失。通過免疫印跡發現，與表達mCherry（紅色熒光蛋白）的Lkb1^flox/flox小鼠相比，表達Cre的ABC-Lkb1^KO小鼠的皮層裂解物中LKB1蛋白的水平降低了約75%，同時睡眠時間也減少了3小時以上。這說明LKB1是促進睡眠的蛋白激酶（圖1）。

與此同時，研究人員觀察到，敲除Lkb1后，小鼠大腦SIK3（鹽誘導激酶3，能磷酸化 組蛋白脫乙?；?（HDAC4））的Thr221（T221）磷酸化水平下降約50%，而在攜帶模擬磷酸化的T221E突變的小鼠中持續激活SIK3蛋白能夠部分恢復因LKB1缺失而減少的睡眠時間，這意味著LKB1-SIK3激酶級聯促進睡眠。SIK3通過對HDAC4的S245或HDAC5的等效殘基的磷酸化和細胞質隔離抑制HDAC4/5活性。研究人員構建了將HDAC4/5的N-末端轉錄因子結合結構域（H4N/H5N）與VP16的反式激活結構域結合的融合蛋白（H4N-VP16/H5N-VP16），可以干擾培養細胞中內源性HDAC4/5的轉錄活性。H4N-VP16和H5N-VP16的ABC共表達完全恢復了ABC-Lkb1^KO 小鼠中的NREMS量和δ功率（衡量睡眠深度的標準）。結果表明LKB1-SIK3通路通過抑制HDAC4/5的活性來促進睡眠。

圖1. LKB1-SIK3信號通過抑制HDAC4/5調節非快動眼睡眠（NREMS）

為了確定HDAC4/5在小鼠大腦中調節睡眠的位置，研究人員在C57BL/6J小鼠的丘腦（THA）、視前區（POA）或下丘腦后部（PH）立體定向注射AAV-hSyn-HDAC4^CN（CN：細胞核）或AAV-hSyn-H4N/H5N-VP16。通過睡眠-覺醒的視頻分析，由AAV介導的HDAC4（CN）或H4N-VP16/H5N-VP16在THA或POA中的表達，沒有觀察到睡眠表型。相比之下，在下丘腦后部HDAC4（CN）的表達減少了每日睡眠量，H4N-VP16/H5N-VP16的表達顯著增加了每日睡眠量。結果表明，HDAC4/5在下丘腦后部調控睡眠時間，并且可能在全新的調控睡眠-覺醒腦區發揮功能。HDAC4/5不能直接與DNA結合，其通過調節多種轉錄因子（包括：MEF2、FOXO和CREB）的活性來發揮轉錄調節功能。研究人員通過篩選發現，與HDAC4/5相關的轉錄因子CREB也能抑制睡眠。為了研究HDAC4和CREB之間的功能關系，研究人員通過在C57BL/6J小鼠中HDAC4（CN）和A-CREB（CREB轉錄活性抑制劑）的ABC共表達進行上位性分析。血凝素、T7（蛋白標簽）和NeuN（能特異性的與神經元細胞核的抗原結合，在正常腦組織的椎體神經元和顆粒性神經元表達）的共免疫染色顯示，小鼠大腦中70%至90%的AAV轉導神經元共表達HDAC4（CN）-HA和A-CREB-T7。?與ABC-HDAC4（CN）和mCherry的ABC共表達相比，HDAC4（CN）和A-CREB的ABC共表達導致每日NREMS量平均增加約318分鐘，而不改變NREMS的δ功率，因此，HDAC4（CN）依賴CREB調節NREMS量（圖2）。

圖2. HDAC4（CN）以CREB依賴的方式調節NREMS量

接下來，通過轉錄組分析和ChIP-seq分析發現，HDAC4和CREB可能結合在相同靶基因的同一位置，并且同向調控其轉錄水平。研究人員在Sleepy突變小鼠中表達HDAC4^CN或CREB均能回補其嗜睡表型，同時也能恢復其轉錄變化，這說明HDAC4/5和CREB位于SIK3激酶下游協同調節睡眠。這一研究結果首次揭示了調控小鼠睡眠時間的核心分子通路：LKB1-SIK3-HDAC4/5-CREB（圖3）。

圖3. 調控睡眠的分子通路模型

現今，睡眠問題越來越年輕化，已然成為全球尤為關注的問題，了解睡眠的調控機制可以幫助我們理解睡眠缺陷與睡眠疾病，并能做出對應的診斷和治療。

云克隆開發了上述研究中涉及到的相關靶標產品，靶標及核心貨號如下，供參考：